70.Приведите общую схему биотехнологического процесса с пояснениями.
Производство аминокислот
Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить следующие
1) в пищевой промышленности: около 30 % производимых аминокислот используется в пищевой промышленности (цистеин предотвращает пригорание пищи, улучшает качество хлеба при выпечке, усиливает запах пищи; глицин, обладающий освежающим, сладковатым вкусом, используется при производстве напитков; глутаминовая кислота – для усиления вкуса и консервирования пищи);
2) в медицинской и фармацевтической практики: ЛП, смеси для ПП, для терапии послеоперационных больных, язвенной болезни, печени, психических заболеваний (серотонин, аспарагин, валин, гистидин, глицин и др.);
3) в химической промышленности аминокислоты используют как предшественники в производстве детергенов, полиаминокислот, полиуретана и т.п.;
4) в сельском хозяйстве: кормовые балансирующие добавки.
Возможны 3 способа промышленного получения незаменимых аминокислот: гидролиз белков растительного и животного происхождения, химический и микробиологический синтез.
Более 60 % всех производимых промышленностью чистых препаратов аминокислот получают путем микробиологического синтеза.
На втором месте по объему производства находится химический синтез. Основным недостатком химического синтеза является получение смеси аминокислот, состоящей из D- и L-изомеров, тогда как биологической активностью в организме человека и животных обладают лишь L-изомеры, а D-изомеры аминокислот не перерабатываются их ферментными системами. Кроме того, некоторые из них токсичны для человека и животных. Исключением в этом отношении является метионин, у которого биологически активными являются как D-, так и L-изомеры, в связи, с чем данная аминокислота производится преимущественно путем химического синтеза. Производство аминокислот связано с использованием дорогостоящего оборудования и нередко агрессивных токсических соединений в качестве исходного сырья. Процесс, как правило, протекает при высокой температуре, требует дорогостоящих катализаторов, и как всякое химическое производство сопровождается образованием побочных продуктов, загрязняет окружающую среду, небезопасно и небезвредно для обслуживающего персонала.
Технологии получения аминокислот за счет гидролиза белков экономически менее выгодны, поэтому они не получили широкого распространения.
Микробиологический способ производства аминокислот, дающий в настоящее время самые высокие технико-экономические показатели по сравнению с др. методами, включает не только биосинтез аминокислот высокоактивными штаммами-продуцентами, но и технологические операции по получению различных товарных форм. При микробиологическом синтезе образуются только L-аминокислоты. Чаще всего для микробиологического синтеза аминокислот используют ауксотрофные мутантные штаммы, которые получают методами селекции или геннетической инженерии. На основе культивирования микроорганизмов для получения чистых препаратов аминокислот применяют промышленные технологии, включающие одно- и двухступенчатый синтез аминокислот.
При одноступенчатом синтезе в промышленных культиваторах выращивают ауксотрофные регуляторные мутанты, являющиеся сверхпродуцентами аминокислот. После завершения рабочего цикла их выращивания культуральную жидкость отделяют от клеток микроорганизмов, сгущают и получают из нее товарный продукт с высокой концентрацией синтезированной микробами аминокислоты.
В процессе двухступенчатого синтеза аминокислоты вначале получают ее предшественник (часто более дешевым химическим синтезом), а затем с помощью ферментов, вырабатываемых микроорганизмами, превращают предшественник в аминокислоту, при этом образуется только L-изомеры. В качестве источника фермента могут быть использованы суспензия клеток микроорганизмов или полученный после разрушения этих клеток ферментный раствор. Этим методом можно производить практически все аминокислоты, но из-за дороговизны и сложности получения кислот-предшественников этот метод не всегда экономически выгоден и в большинстве случаев уступает методу прямого микробиологического синтеза.
Продуценты аминокислот. В качестве продуцентов аминокислот используют генетически измененные штаммы, обладающие способностью к сверхсинтезу аминокислот. Лучшими продуцентами аминокислот являются ауксотрофные мутанты (микроорганизмы, лишенные ряда ферментных систем, поэтому очень требовательны к составу питательной среды, в которой должно присутствовать большое количество факторов роста). В качестве продуцентов аминокислот используют грамположительные бесспоровые бактерии рода Corynebacterium, Brevibacterium и Micrococcus. Путём трансаминирования α-кетокислот, образующихся из глюкозы, синтезируются аминокислоты (см. схему А на с. 492).
Глутамат также образуется при восстановительном аминировании α-кетоглутарата глутаматдегидрогеназой.
Эти реакции обратимы и играют большую роль как в процессе синтеза аминокислот, так и при их катаболизме. Такие реакции, выполняющие двойную функцию, называют амфиболическими.
491
Рис. 9-23. Пути биосинтеза заменимых аминокислот.
Схема А
492
Амиды глутамин и аспарагин синтезируются из соответствующих дикарбоновых аминокислот Глу и Асп (см. схему А).
Серин образуется из 3-фосфоглицерата – промежуточного продукта гликолиза, который окисляется до 3-фосфопирувата и затем трансаминируется с образованием се-рина (см. схему Б).
Существует 2 пути синтеза глицина:
1) из серина с участием производного фолиевой кислоты в результате действия се-риноксиметилтрансферазы:
2) в результате действия фермента глицинсинтазы в реакции:
Пролин синтезируется из глутамата в цепи обратимых реакций. Эти же реакции используются и при катаболизме пролита (см. схему В на с. 494).
Кроме восьми перечисленных заменимых аминокислот, в организме человека могут синтезироваться ещё четыре аминокислоты.
Частично заменимые аминокислоты Apr и Гис синтезируются сложным путём в небольших количествах. Большая их часть должна поступать с пищей.
Синтез аргинина происходит в реакциях орнитинового цикла (см. выше подраздел IV);
Гистидин синтезируется из АТФ и рибозы. Часть имидазольного цикла гистидина – N=CH-NH- образуется из пуринового ядра аденина, источником которого служит АТФ, остальная часть молекулы – из атомов рибозы. При этом образуется 5-фосфорибозиламин, который кроме синтеза гистидина необходим для синтеза пуринов.
Для синтеза условно заменимых аминокислот тирозина и цистеина требуются незаменимые аминокислоты фенилаланин и метионин соответственно (см. подразделы VIII и IX).
Образование других аминокислот также возможно при наличии соответствующих α-кетокислот,
Схема А
Схема Б
493
Схема В
которые могут трансаминироваться с глутаматом. Таким образом, незаменимой частью молекулы аминокислот является их углеродный скелет. Источником таких незаменимых ос-кетокислот служат только белки пищи. Исключение составляют лизин и треонин, которые не подвергаются трансаминированию, их а-кетоаналоги с пищей практически не поступают и в организме не синтезируются. Единственный источник этих аминокислот – пищевые белки.
72. Дайте определение «моноклональные антнтела»
Реакция с йодной кислотой может дать еще одну ценную информацию оструктуре сахаров. На схеме видно, что диальдегид, полученный при окислении пиранозида йодной кислотой, содержит два хиральных центра(отмеченных звездочкой) с конфигурацией, сохранившейся от исходного гликозида. Один из них является предпоследним углеродным атомом в цепи,конфигурация которого по определению такая же, как и у всех других о-сахаров, в то время как второй хиральный центр в диальдегиде—это атом углерода ацетальной функции, альтернативная конфигурация которогодает аномерные гликозиды. Таким образом, используя реакцию с йодной кислотой, можно соотно- [c.276] Таким образом, установив, что вследствие индивидуальной структуры фермента определенные группы в полипептидной цепи расположены специфическим образом, мьт можем представить образование активного центра, который в дальнейшем и предопределяет природу превращений, приводящих к образованию того или иного продукта реакции. Сама жеферментативная реакция протекает в составе активного комплекса,который образуется при взаимодействии фермента и субстрата, при этом связывание с активным центром фермента происходит в результате образования специфических нековалентных связей, в том числе гидрофобных, и электростатического взаимодействия. Влияние специфических групп фермента за счет кооперативности дестабилизируетсвязи субстрата, который превращается в более реакционноспособное соединение. В соответствии с этим можно дать определение активного центра как участка белка фермента, который включает все специфические группы, участвующие в образовании активного комплекса [25]. [c.165] Но и этого еще недостаточно необходимо иметь, кроме того, спо- соб количественного исчисления активных центров и определения отсюда ихабсолютной активности, т. е. производительности одного активного центра. Только путем сопоставления таких абсолютных активностей для разных процессов и в разных условиях можно проникнуть в механизм катализа и поднять его на уровень современных физических теорий. Никакие условныемеры активности — вроде расчета на единицу веса, на единицу поверхности, сопоставление энергии актива- ции — не могут дать сколько-нибудь надежных результатов (см. доклад Атом, кристалл и электрон в катализе ). Анализировать механизм катализа без знания структуры активного центра и его активности — это все равно, что судить обэнергетических уровнях атомов или молекул по спектрам, не зная волновых чисел спектральных линий и их интенсивностей. [c.43] Чтобы дать определение замещения с точки зрения механизма этого процесса, необходимо связать его с происходящими при этоммолекулярными превращениями и ввести термин простое замещение . Последнее определяется как вытеснение какого-то лиганда изкоординационной оболочки другим лигандом из числа окружающих, причем такой процесс не связан с какими-либо сложностями и состоит лишь во временном изменении координационного числа реакционного центра. Таким образом, процесс замещения связан с образованием новых и разрывом старых связей, и при описании его механизма мы имеем дело преимущественно с изменениями в распределении электронов в ходе образования иразрушения связей, а также с временем протекания реакции. [c.30] Основная задача, которую ставили перед собой авторы книги, по существу решена — мы рассмотрели все те вопросы, которые считали важными. Однако нам представляется интересным показать, как, используя рассмотренные нами простые реакции, можно осуществить чрезвычайноважные процессы, которые могут дать определенный экономический эффект. Мы должны также помнить, что ионы металлов входят во многиебиологические системы и активный центр такой системы можно рассматривать как металлокомплекс. Термин реакции координированных лигандов можно применить к реакциям, протекающим в системах, играющихважную роль во многих процессах, таких, например, как перенос кислорода(гемоглобин включает комплекс железа с макроциклическимитетрадентатными лигандами, в котором атомами-донорами служат атомы азота), фотосинтез (хлорофилл — магниевый комплекс другого макроциклического тетраден-татного лиганда, роль атома-донора в нем также выполняет азот) и многие ферментативные процессы. [c.245] И металлических защитных покрытий, некоторые случаи испытаний металлов в атмосфере и др. Иногда при осмотре испытуемого образца можно дать количественную характеристику интенсивности коррозии. Для этого надо отметить время появления первого коррозионного центра или числокоррозионных центров через определенное время испытания. [c.102] Аналогичное изменение состава сополимера отмечалось также вприсутствии реагента, образующего комплекс преимущественно с одним издвух мономеров [64]. Следовательно, простое определение отношения реакционных способностей мономеров для пары мономеров позволяет довольно полно охарактеризовать их поведение при сополимеризации. С другой стороны, отношения реакционноспособности мономеровдействительно несколько изменяются с температурой [58, 87] и очень сильноизменяются, если активные центры, участвующие в сополимеризации, из радикалов переходят в ионы. Ионная сополимеризация рассматривается в одном из следующих разделов настоящей главы, однако здесь можно отметить, что определение состава сополимеров может дать простой способустановления механизма действия нового инициатора полимеризации. [c.139] Поиски места утечки газа из подземного газопровода на первой стадиисводятся к ориентировочному (грубому) определению центра зоны распространения газа в грунте. Поэтому число предварительных (ориентирующих) скважин должно быть как можно меньше. Располагать их следует сравнительно далеко друг от друга. На каждой линии следуетзакладывать в лучшем случае 3, но никак не более 5 скважин. Эти скважины должны дать ответ на вопрос о направлении распространения газа по грунту. После нахождения центра зоны распространения газа закладывают дополнительные (уточняющие) скважины, позволяющие аварийной бригадеболее или менее точно выйти непосредственно к месту утечки. [c.361] Тетраэдрическую модель строения органических соединенийпредложили Вант-Гофф и Ле Бель в 1874 г. Они пришли к выводу, что если две молекулы являются стереоизомерами, то их можно описать зеркальными формулами, и если один изомер вра-шает плоскость поляризации влево, то второй должен вращать вправо. По знаку вращения можно определитьотносительную конфигурацию стереоизомеров. Однако между абсолютнойконфигурацией, т.е. истинным расположением групп вокруг данногохирального центра, и знаком вращения прямого соответствия нет. Определить абсолютную конфигурацию химическими методами, если не известна абсолютная конфигурация хотя бы одного хирального реагента (а так и было вначале), невозможно. Спектральные методы могуг дать информацию только об относительной конфигурации. В настоящее времясуществуют лишь два метода независимого определения абсолютной конфигурации теоретический расчет и исследование аномальнойдифракции рентгеновских лучей на ядрах тяжелых элементов. [c.34] Центр тяжести площади под кривой имеет, таким образом, определенный физический смысл. В общем случае центр тяжести отличается от величины, которая в статистике называется модусом и характеризует, например, точку перегиба интегральной кривой распределения (фронтальная кривая) или максимум дифференциальной кривой распределения (кривая проявительной хроматографии), причем модусу нельзя дать простую физическую интерпретацию. Положение центра тяжести не зависит откинетических постоянных в области, где Вр пренебрежимо мало, и поэтому не зависит также от скорости, с которой устанавливается в колонке равновесие. [c.447] Из-за сложности физических свойств цеолитов им трудно дать точное определение. Так, автор этой главы [6] предлагает называть цеолитами алюмосиликаты с каркасной структурой, в которой имеются полости, занятыебольшими ионами и молекулами воды, причем и те и другие характеризуются значительной подвижностью, что обеспечиваетвозможность ионного обмена и обратимой дегидратации . Каркасная структура построена из соединенных вершинами тетраэдров, в. которых малые атомы (называемые Т-атомами) лежат в центрах тетраэдров и атомы кислорода —в их вершинах. Положения Т в природных цеолитах заняты преимущественно атомами А1 и 81, но в синтетических цеолитах их можно заменить на близкие по природе атомы Оа, Ое и Р. Роль больших ионов в полостях природных цеолитов выполняют одно- и двузарядные катионы Ка, Са,. К, Mg и Ва, содержание которых зависит от геохимического состава [c.11] Как указывалось выше, при анализе результатов, полученных хроматографическими методами, следует учитывать, что катализатор в промежутках между импульсами подвергается частичной регенерациипотоком газа-носителя, вследствие чего стационарное состояние катализатора может и не достигаться. В принципе, результаты кинетическихрасчетов, полученные на основе хроматографических данных, могут отличаться от констант, соответствующих стационарному состоянию катализатора (см., например, стр. 193), но это скорее достоинство, а не недостаток. Хроматографические данные представляют значительный интерес, поскольку они характеризуют наиболее активные в каталитическом отношении центры поверхности. Сопоставление результатов, полученных вхроматографических условиях, с результатами, полученными в проточных ипроточно-циркуляционных системах, может дать дополнительносущественную информацию о кинетике и механизме каталитического процесса. Мы уже указывали выше, что эффективность кинетическихисследований значительно повышается при проведении опытов поопределенной стратегии. Этому вопросу посвящен специальный разделматематической статистики, называемый планирование экстремальных экспериментов . Поэтому прежде чем перейти к изложениюэкспериментального материала, мы посвятим следующий раздел краткому изложению некоторых основных идей статистического планированияэксперимента. [c.301] Для практического применения цеолитов в большинстве случаев наиболее важными, являются их поверхностные свойства и реакционная способность, ИК-спектроскопия может дать полезную и часто вполне определенную информацию о структуре и поверхностных свойствах цеолитов, а также показать, каким образом они меняются в ходе реакции или при различных обработках. Изменения в спектрах цеолитов и адсорбированных молекул позволяют непосредственно судить об особенностях поверхности, характере адсорбции, природе адсорбционных центров и о взаимодействии адсорбированных молекул с этими центрами. [c.147] Существование подвижных протонов на поверхности твердых окислов имеет большое значение в катализе. В частности, число делокализованных протонов на поверхности декатионированной формы цеолита V имеет такой же порядок, как и число активных центров, найденное при определении каталитической активности в реакциях кислотного типа. Эти протоны могутиграть роль сильных кислотных центров, а поверхность каналов цеолитов может дать протонам благоприятную возможность для перемещения. На окиси кремния в отличие от декатионированных цеолитов делокализацию протонов методами ИК-спектроскопии обнаружить не удалось. Известно также, что окись кремния является плохим катализатором реакцийкислотного типа. На связи химии поверхности цеолитов с ихкаталитическими свойствами мы подробнее остановимся ниже. [c.225] К энергетическим факторам относятся также свободная энергия, энтальпия и энтропия веществ на каталитически активных центрах. Автором был дан метод экспериментального определения их изменения из кинетики реакций. В 1957 г. оказалось возможным дать сводку их значений дляадсорбционного вытеснения приблизительно ста пар веществ на разных катализаторах [4]. [c.326] Возвращаясь к вопросу о существовании универсальных значений а для замещенных алициклических систем, мы должны дать отрицательный ответ. Это является однозначным следствием из наблюдаемого непостоянства величины для каждой данной циклической системы. Однако определенные изразличных реакционных серий величины о для циклов, замещенных нормальными электроотрицательными заместителями, пропорциональныдруг другу. Это находит выражение в соблюдении уравнения Тафта при условии рассмотрения цикла в качестве составной части реакционного центра. Последний факт одновременно подтверждает, что величины о для нормальных электроотрицательных заместителей действительно являются универсальными постоянными и нельзя абсолютизировать значение техкритических замечаний, которые были по этому поводу сделаны в предыдущем параграфе. [c.142] В работе [189] подчеркивается, что при использовании импульсной хроматографической методики увеличение степени покрытия поверхностикатализатора молекулами яда следует проводить за счет увеличения дозы яда, а не последовательно вводить одинаковые дозы. После определенияактивности образца, перед введением новой порции яда, следует проводить регенерацию катализатора. На рис. VI.67 кривая 1 соответствует изотерме отравления с регенерацией катализатора перед введением новой порции яда, а кривые 2, 3 ж 4 введению последовательных порций яда безпредварительной регенерации катализатора (яд вводили через интервалы в 30, 20 и 15 мин соответственно). Из рисунка видно, что в области больших доз яда все кривые совпадают. Поскольку наклон начального участка зависит от интервалов ввода доз яда, метод, использованный Туркевичем в работе [169], может дать различные количества активных центров, т. е. привести к ошибочным результатам. [c.362] Для иммобилизованных ферментов наряду с определением содержания связанного белка, общей или относительной активности дополнительнуюценную информацию может дать также титрование активных центров. Примеры приведены в разд. 9.4. Некоторые методики для наблюдения законформационными изменениями даны в разд. 9.5, а методы исследования распределения белков, связанных на поверхности нерастворимого носителя,— в разд. 9.6. [c.236] Расхождения между различными шкалами можно понять прежде всего в терминах предложенной Пирсоном концепции жестких и мягких кислот иоснований принцип ЖМКО) [60, 108 — 110]. Согласно этим представлениям, предпочтительными оказываются взаимодействия между жесткими кислотами и жесткими основаниями и взаимодействия между мягкими кислотами и мягкими основаниями. По существу, величины и Пр типичны для мягких электрофильных центров, причем Pt(II) — даже более мягкий центр, чем углерод в метилиодиде. С другой стороны, ванадий(1У) являетсяопределенно жестким центром. Таким образом, последовательность (7-III) может дать полезные сведения о структуре первой сольватной оболочкигалогенидов металлов и псевдогалогенидов жестких ионов металлов вневодных растворителях. Эти знания очень нужны при изучении механизмов реакций с участием ионов металлов. [c.201] Для проведения измерений следует разарретировать гальванометр, установить его стрелку корректором на нуль, включить в сеть и дать прогреться не менее 10 мин. Тем временем устанавливают в штатив необходимую пару электродов, например каломельный и платиновый, и соответствующий стаканчик с исследуемым раствором. Усилитель настраивают путем вращения одной из ручек 9 при определенном положениипереключателей 6. После настройки стрелка гальванометра должна стоять на нуле. Точно так же, но с помощью другой ручки 9 (правой) и переключателей 6 настраивают потенциометрическую часть по нормальному элементу. Дляпроведения измерений переключатели 6 ставят в соответствующее положение и поворотом маховичка 2 измерительного реохорда (при нажатой кнопке в центре маховичка) добиваются отсутствия тока в нуль-гальванометре. Отсчет (в милливольтах) делают по шкале 3. [c.49] В табл. 5 представлены данные, полученные для гидроксильных производных в основном стероидного ряда приведены амплитуды и длины волн максимумов. Не следует придавать особого значения различным длинам волн определенных соединений, поскольку, как уже говорилось выше, круговой дихроизм нитритов обычно проявляется в виде нескольких пиков. Два наиболее важных среди них, расположенные в середине полосы, имеют почти одинаковые амплитуды. Преобладание какого-либо из этих пиков зависит от соединения, и отсюда понятно, почему длины волн максимумов в табл. 1 можно разбить на две группы. По-видимому, более разумно дать длинуволны, соответствующую геометрическому центру полосы, однако точно ее трудно определить, особенно когда молекула содержит дополнительные хромофоры, поглощение которых накладывается на [c.206] Первая операция при определении полной пространственной симметрии кристалла заключается в установлении его точечной группы (приложение III). Точечную труппу хорошо сформированного кристалла можно установить при изучении расположения его граней. Если же грани образованы недостаточно хорошо, то внутреннюю симметрию необходимо определить рентгенографически. Рентгенографическое определение, впрочем, всегда проводят в качестве контрольного. Элементы симметрии кристалла можно установить по лауэграмме, например приведенной на рис. IV.1. На лауэграмме каждый элемент симметрии кристалла, совпадающий с осью лучкарентгеновских лучей, будет проявляться на пленке в виде симметричного расположения рефлексов. Так, из рис. IV.1 следует, что имеется ось 2-го порядка и две плоскости отражения, параллельные пучку рентгеновских лучей. Для определения всех элементов симметрии необходимо проверить всеориентации кристалла, так чтобы каждая из осей или плоскостей сталапараллельной пучку и могла бы быть при этом идентифицирована. Таким образом определяется полный набор элементов симметрии, составляющий одну из точечных групп. Существенным препятствием для осуществления этой процедуры является тот факт, что все кристаллы при рентгеноструктурном исследовании кажутся центросимметричными, поскольку отражение от одной стороны набора плоскостей решетки обычно неотличимо от отражения от другой стороны. Для преодоления этой трудности были разработаныспециальные методы. Простейший из них заключается в изучении внешней формы кристалла, позволяющей судить, существует ли центр симметрии.Примечательно, что простое макроскопическое наблюдение в этом случае может дать существенную информацию, дополняющую ту, которая получается при использовании метода дифракции рентгеновскихлучей. [c.772] II субстрата, при этом связывание с активным центром ферментапроисходит в результате образования специфических нековалентных свя-зс11. в том числе гидрофобных, и электростатического взаимодейст-иия.Влияние специфических групп фермента за счет кооперативности дестабилизирует связи субстрата, который превращается в болеереакционноспособное соединение. В соответствии с этим можно дать определение активного центра как участка белка фермента, который включает все специфические группы, участвующие в образовании активногокомплекса [251. [c.205] У кристаллов тепловое движение недостаточно для того, чтобы преодолеть упорядочивающие силы, если исключить отдельные необычнобольшие колебания, которые приводят к перемене положения вкристаллической решетке и вызывают диффузию в кристаллах. Различие, имеющееся между стабильным упорядочением в кристалле и неустойчивым частичным упорядочением в жидкости, можно использовать и для того, чтобы дать определения понятий жидкости и к ристалла. В жидкости частицасовершает колебательные движения вокруг точки, которая сама сравнительно медленно и неравномерно движется. В кристалле центрколебания для всех частиц закреплен в [юстроенной по законам симметриирешетке. [c.271] Недавние исследования динамики молекулы лизоцима с помощьюкристаллографических методов показали [55, 56], что атомные смещения в белке наиболее выражены в области активного центра фермента. Хотя эти исследования иока носят лишь постановочный характер, не исключено, что в будущем применение рентгеноструктурного анализа именно для изучениядинамических свойств молекул белка (определение средних амплитуд смещения каждого атома от его усреднеппой позиции в кристалле), помимо зарекомендовавших себя исследований статических свойств белковыхмолекул в кристалле (оиределение усредненных координат всех атомов в молекуле на основе соответствующего распределения электронных плотностей), может дать важную и принципиально новую информацию оструктуре ферментов н механизмах их действия. Далее, обещающими являются новые возможности прямого рентгеиоструктурного анализапромежуточных состояний в ферментативном катализе путем охлаждениякристаллов фер-мент-субстратного комплекса в подходящихводноорганических растворителях и определепия структуры образующихсямолекулярных комплексов непосредственно в ходе реакции [57, 58]. Этот [c.158] Для определения оптической чистоты может служить и метод разделенияс помощью газо-жидкостной хроматографии. Вещество, оптическую чистотукоторого хотят определить, действием оптически чистого реагента переводят в производное, которое будет содержать уже два хиральных центра. Если вещество было оптически чистым, то образуется одиндиастереомер, если же оно содержало примесь второго антипода, то образуются два диастереомера. При газо-жидкостной хроматографии диастереомеры могут дать раздель- [c.162] Как уже было показано, наиболее важное наблюдаемое отличие одного энантиомера от другого связано с их различным действием на поляризованный свет. На протяжении более чем столетия после открытияоптической изомерии единственным неизменным способом обозначенияразличия между энантиомерами была ссылка на направление вращения плоскости света, с тех пор и используется ( + )- и (—)-номенклатура. Хотя уже давно было ясно, что вращение поляризованного света обусловленоразличной конфигурацией молекулы, не было способа определения абсолютной конфигурации (т. е. истинного пространственного расположения групп в молекуле). Очень скоро было обнаружено, что нет простого соотношения между знаком вращения поляризованного света иконфигурацией молекулы. Так, правовращающий спирт мог образовать левовращающий ацетат и правовращающий бензоат или левовра-щающпй амии мог дать правовращающий протонированный катион. Существует немало подобных примеров, где реакции, не изменяющие конфигурацию уасимметрического центра, дают продукты с другой оптической активностью по сравнению с активностью исходного вещества. [c.200] Представление о молекулах как о геометрических фигурах является вхимии одним из шавнейших и находит свое отражение не только в привычныхструктурных формулах, но и лежит в основе всей стереохимии,молекулярно-динамического моделирования, биохимии итд Однако только этого недостаточно Хорошо известно, какую роль в химии при прогнозе тех или иных химических реакций имеют так называемые заряды на атомах Возникает, таким образом, проблема дать достаточно четкое определение этого понятия Проще всего это сделать, если опереться на факт существования внешнего электростатического поля, которое создает вокруг себя любая молекула. В этом смысле нет никакой разницы между взглядамиклассической физики и квантовой как классическая, так и квантоваяустойчивая электрически нейтральная система, состоящая из частиц сзарядами разного знака и по разному распределенными в пространстве молекулы, должна, в зависимости от своей геометрии и распределения заряда, создавать электрическое поле Это поле всегда может быть представлено в виде так называемого муяьтипольного разло-женйя, т.е как суперпозиция дипольной составляющей, квадрупольной и тд Дипольная составляющая отсутствует в молекулах, имеющих центр симметрии Так какцентр симметрии не так уж часто встречается в слож- [c.163] Хотя регистрация изменений магнитной релаксации ядер Н, и Р наталкивается на еще большие трудности, подобные измерения могут дать чрезвычайно полезную информацию о геометрии активных центров. Расчеты опираются на ту закономерность, что воздействие на релаксацию ядраубывает с ростом межъядерного расстояния г пропор-тционально 1/л . Хотятеория этих явлений очень сложна, при определенных условияхсоответствующие уравнения упрощаются и принимают вид [c.128] Этот фермент действует также на О- и Ь-аланин причем, декарбокси-лируя О-аланин, у Ь-аланина он катализирует только диссоциацию а-водорода. Этим данным можно дать разумное объяснение, если исходить из предположения, что фермент обладает определенным якорным центром для одной алкильной группы, тогда как место второй алкильной группы может быть занято а-водородом или карбоксилат-ионом, и что лабилизуемая группа расположена перпендикулярно я-системе [c.226] В отношении акцепторного субстрата реакции некоторые сведения могло бы дать изучение пуромицина и его аналогов. Так, известна конформация пуромицина в кристалле, определенная рентгеноструктурным анализом (рис. 104). Она подтверждается исследованиями пуромицина в растворе. Так как пуромицин — хороший акцепторный субстрат в реакции транспептидации, знание его структуры может навести на некоторые суждения о стереохимии аминоацильного и аденозинЬвого остатков в пептидилтрансферазном центре. Далее, известно, что аналог с более фиксированной конформацией, типа изображенного на рис. 105, тоже может служить в качестве акцепторного субстрата в реакции транспептидации, и даже более активен, чем пуромицин. Здесь фиксирована ориентация пуринового кольца относительно рибозы (так называемая анти -ориентация), и это позволяет думать, что именно она [c.191] Активность ферментов как катализаторов выражали многими способами. Одним из часто используемых способов является выражение ее через число оборотов Т.М. Последнее определяют [1] как число циклов, претерпеваемых во время каталитической реакции одной простетической группой ферментав одну минуту, т. е. как число молекул субстрата, реагирующих в минуту на одном активном центре фермента. Однако применялись и некоторые другие определения числа оборотов при любом способе измерения Т. N. следует указывать концентрацию субстрата и то, была ли она достаточной, чтобыдать максимальную скорость. Другой мерой [8, 3] является начальная константа скорости к реакции при низких концентрациях субстрата, где V = к [8]о[Е]о для реакции с одним субстратом, или к [8]о[Е]о[Т]о длябимолекулярной реакции. Эта характеристика имеет преимущество, являясь доступной мерой для многих реакций, катализируемых ферментами, и, кроме того, для тех же самых реакций в присутствии других катализаторов, которые не могут, например, дать предельно максимальную скорость. Однако, возможно, огромное преимущество может дать отнесение к к числу активных центров в молекуле фермента, точно так же как в кислотно-основном катализе константу скорости каталитической реакции делят на число доступных протонов кислотного катализатора. Аналогичным образом при сравнении фермента каталазы с коллоидальной платиной для реакции разложения перекиси водорода каждая частица может оказаться такой же активной, как и отдельная молекула фермента [8]. Однако каждая частица с радиусом 500 А имеет на поверхности приблизительно 3-10 атомов металла, каждый из которых, возможно, является самостоятельным активным центром, так что, относя к одному центру, можно видеть, что фермент оказывается намного более активным. Как показано в табл. 2, ферментативные реакциихарактеризуются более низкой энергией активации приблизительно на 10 ктл/моль, это может легко объяснить различие в активностях. В табл. 8некоторые ферменты сравниваются с другими каталитически действующимиионами. [c.139] Изучение скоростей ферментативных реакций при различных значениях концентраций субстрата и pH дает возможность вычислить значения констант диссоциации Ка, Кь, Ка, Кь- Величины двух первых констант, соответствующих свободному энзиму, имеют большое значение, так как приводят к определенным выводам относительно природы ионизирующей группы в активном центре. Так пепсин — энзим, катализирующий гидролизопределенных пептидов в желудке, — имеет рК 2,2 известна только однаорганическая группа, которая может дать такую величину, а именнокарбоксильная группа — СООН. Подобным образом различные энзимы, такие, как химотрипсин и хо-линэстераза, имеют рК около 7,2, что почти с полной уверенностью можно отнести к ионизации протона, связанного с кольцевым атомом азота в имидазоле [c.289] Классическим примером проводников, действующих по ион-радикальному механизму, являются соли на основе тетрацианхинодиметана (ТСЫР). Проводимость в таких системах обычно связывают с образованием КПЗмежду молекулами ТСНР [67]. Очевидно, что для эффективного переносаэлектрона из полупроводника в активный центр фермента должносуществовать определенное энергетическое соответствие, например, между уровнем Ферми полупроводника и окислительно-восстановительнымпотенциалом группы активного центра, акцептирующей электрон.Систематические исследования в этой области пока отсутствуют дать обоснованные рекомендации еще нельзя. [c.81] В связи с выгаесказанпым, по-видимому, целесообразно дать болео полное определение Ж. п. как систе м, содержащих кинетически стабильныеактивные центры, в к-р ы X все макромолекулы могут участвовать в росте цепис равной вероятностью. [c.389] Рассматривая элементы симметрии, авторы книги не дали определения понятия центр симметрии , хотя широко его использовали. Для чнтателя-учащегося мы сочли целесообразным дать это определение, стольсущественное в учении о симметрии кристаллов (см. примечание к стр. 218). [c.13] В качестве первого шага в этом направлении следует дать более ясноеопределение некоторых понятий. Мы имеем право сказать, что молекула проявляет в данной реакции нуклеофильные свойства, если она содержитбогатый электронами центр, который может вступать в связь с атакующей молекулой при меньшей величине АР, чем любой из ее бедных электронами центров. Более того, если сравнивать две таких молекулы по отношению к их реакции с данным атакующим реагентом, то. моясно сказать, что той из них, которая реагирует при меньшем АР, может быть приписана более высокаянуклеофильная реакционная способность. [c.253]
73. Охарактеризуйте стадию очистки в биотехнологическом производстве
Охарактеризуйте стадию очистки в биотехнологическом производстве Основной стадией является собственно биотехнологическая стадия, на которой с использованием того или иного биологического агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов или клеточных органелл) происходит преобразование сырья в тот или иной целевой продукт.
Обычно главной задачей биотехнологической стадии является получение определенного органического вещества.
Однако биотехнологическая стадия, как правило, включает в себя не только синтез новых органических соединений, но и ряд других биотехнологических процессов, перечисленных далее.
Ферментация — процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов.
Биотрансформация — процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов. В этом процессе обычно не происходит накопления клеток микроорганизмов, а химическая структура вещества меняется незначительно. Вещество как бы уже в основном готово, биотрансформация осуществляет его химическую модификацию: добавляет или отнимает радикалы, гидроксильныеионы, дегидрирует и т. п.
Биокатализ — химические превращения вещества, протекающие с использованием биокатализаторов-ферментов.
ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ СТАДИИ
Подготовительные стадии служат для приготовления и подготовки необходимых видов сырья биотехнологической стадии.
На стадии подготовки могут быть использованы следующие процессы.
Приготовление среды, обычно жидкой, включающей необходимые компоненты питания для биотехнологической стадии.
Стерилизация среды — для асептических биотехнологических процессов, где нежелательно попадание посторонней микрофлоры.
Подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха), необходимых для протекания биотехнологического процесса. Чаще всего подготовка воздуха заключается в очистке его от пыли и влаги, обеспечении требуемой температуры и очистке от присутствующих в воздухе микроорганизмов, включая споры.
Подготовка посевного материала. Очевидно, что для проведения микробиологического процесса или процесса культивирования изолированных клеток растений или животных необходимо подготовить и посевной материал — предварительно выращенное малое по сравнению с основной стадией количество биологического агента.
Подготовка биокатализатора. Для процессов биотрансформации или биокатализа необходимо предварительно подготовить биокатализатор — либо фермент в свободном или закрепленном на носителе виде, либо биомассу микроорганизмов, выращенную предварительно до состояния, в котором проявляется ее ферментативная активность.
Предварительная обработка сырья. Если сырье поступает в производство в виде, непригодном для непосредственного использования в биотехнологическом процессе, то проводят операцию по предварительной подготовке сырья. Например, при получении спирта пшеницу сначала дробят, а затем подвергают ферментативному процессу «осахаривания», после чего осахаренное сусло на биотехнологической стадии путем ферментации превращается в спирт.
Другой пример — использование древесины для получения дрожжей. Древесину сначала измельчают, а затем подвергают нагреву до 200°С в кислой среде. В результате такого процесса кислотного гидролиза происходит превращение древесины в раствор глюкозы и лигнин. Раствор глюкозы (гидролизат) как раз и используется в биотехнологическом процессе для получения кормовых дрожжей.
Переходим теперь к стадии, следующей за биотехнологической.
РАЗДЕЛЕНИЕ ЖИДКОСТИ И БИОМАССЫ
Чаще всего целевой продукт находится либо в самой биомассе, либо в жидкости. В обоих случаях необходимо сначала разделить эти две фазы. В зависимости от свойств биомассы и жидкости для этих целей могут быть использованы различные процессы.
Отстаивание — разделение под действием гравитационных сил (обычно при очистке сточных вод).
Фильтрация — пропускание суспензии через фильтрующий материал, на котором задерживаются частицы твердой фазы — биомасса. Такой способ применяют в производстве антибиотиков, особенно в тех случаях, когда микроорганизм-продуцент имеет мицелиальный характер.
Сепарация, центрифугирование — разделение под действием центробежных сил. Наиболее часто используется для отделения дрожжей или бактерий в производстве кормовой биомассы.
Микрофильтрация, ультрафильтрация — пропускание суспензии через мембраны с весьма малым размером пор, обеспечивающее удержание клеток микроорганизмов на мембране и получение раствора, свободного от взвешенных клеток. Ультрафильтрация задерживает уже не только клетки, но и крупные молекулы растворенных веществ.
Коагуляция — добавление в суспензию реагентов, способствующих образованию и осаждению более крупных клеточных агломератов и отделению их от жидкости путем отстаивания.
Флотация — захват биомассы микроорганизмов пузырьками пены и выделение ее из пенной фракции.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ БИОСИНТЕЗА
Эта стадия имеет определенные отличия, связанные с тем, являются продукты внеклеточными или внутриклеточными.
Так, для внутриклеточных продуктов сначала необходимо разрушить клеточную оболочку одним из методов, среди которых можно назвать следующие.
Дезинтеграция клеток. Этот процесс разрушения клеточной оболочки может осуществляться физическими методами (с помощью мелющих тел, путем замораживания и продавливания, воздействием ультразвуком, методом декомпрессии — резкого сброса давления) или химическими и биотехнологическими методами.
Гидролиз — разрушение клеточных оболочек под действием химических реагентов и температуры.
Ферментолиз — разрушение клеточных оболочек под действием ферментов при повышенной температуре.
Автолиз — разновидность ферментолиза, когда используют собственные ферменты клетки.
После проведения предварительной операции разрушения клеток выделение целевого продукта осуществляется из раствора методами, которые являются общими для внеклеточных и внутриклеточных продуктов.
Экстракция — переход целевого продукта из водной фазы в не-смешивающуюся с водой органическую жидкость (экстрагент). Наиболее известно выделение жироподобных веществ жидкими углеводородами (типа бензина), но применяются и многие другие виды экстрагентов (хлороформ, эфир, бутилацетат). Экстракция прямо из твердой фазы (в том числе и биомассы микроорганизмов) называется экстрагированием.
Осаждение — выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящего его в твердую фазу.
Адсорбция — перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его сорбции на специальных твердых носителях (сорбентах).
Ионный обмен — то же, что адсорбция, но в этом случае в твердую фазу переходят ионы (катионы или анионы), а не целиком молекула целевого продукта или примеси.
Отгонка, ректификация — эти методы используют для выделения растворенных в культуральной жидкости легкокипящих продуктов. Пример — этиловый спирт.
Ультрафильтрация, нанофилырация и обратный осмос применяются для выделения высокомолекулярных соединений (белков, полипептидов, полинуклеотидов). Обратный осмос и нанофильтрация позволяют отделять даже небольшие по размеру молекулы.
Центрифугирование, ультрацентрифугирование используют для выделения вирусов, клеточных органелл, высокомолекулярных соединений.
ОЧИСТКА ПРОДУКТА
На стадии выделения продукта главная задача — отделить основную часть продукта, пусть даже и с некоторыми примесями. Получается как бы неочищенный продукт. Поэтому, когда необходимо получать биопродукты высокой кондиции, добавляют еще стадию очистки продукта. Задача этой стадии — убрать примеси, сделать продукт максимально чистым.
Эта задача решается с помощью разнообразных процессов, в числе которых многие из тех, что уже были рассмотрены ранее. Это экстракция и экстрагирование, адсорбция, ионный обмен, ультрафильтрация и обратный осмос, ректификация и ферментолиз. Кроме этих процессов используют и следующие.
Хроматография — процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Например, смеси белков, нуклеотидов, Сахаров, антибиотиков. При адсорбции они и десорбируются вместе. А вот при хроматографии они выходят из сорбента как бы по очереди, что и позволяет их разделять и, значит, очищать друг от друга.
Диализ — процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей.
Кристаллизация. Этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах. Медленное охлаждение позволяет формировать кристаллы из растворов целевых продуктов, причем чистота их обычно очень высока. Вся «грязь» остается в маточном растворе. Таким образом, например, получают кристаллы пенициллина.
Можно даже получить еще более чистый продукт, если кристаллы растворить в воде или растворителе, а потом снова кристаллизовать (т. е. провести процесс перекристаллизации).
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ПРОДУКТА
После очистки продукта он часто находится все-таки в растворе с небольшими концентрациями примесей. Дальнейшая задача — обеспечить его концентрирование.
Кстати, необходимо рассмотреть, как обычно меняется концентрация целевого продукта от
биотехнологической стадии до готовой формы продукта. На выходе из биотехнологической стадии суспензия обычно содержит целевого продукта примерно 0,1 — 1%, после стадии отделения биомассы — 0,1—2%, после стадии выделения— 1—10%, после очистки — 50—80%, и, наконец, после концентрирования — 90—100%.
На стадии концентрирования применяют такие процессы, как выпаривание, сушка, осаждение, кристаллизация с фильтрацией получившихся кристаллов, ультрафильтрация и гиперфильтрация или нанофильтрация, обеспечивающие как бы «отжим» растворителя из раствора.
ПОЛУЧЕНИЕ ГОТОВОЙ ФОРМЫ ПРОДУКТА
На завершающей стадии производства продукт приобретает товарную форму за счет проведения процессов гранулирования (формирование гранул из порошка или прямо из раствора), дражирования, таблетирования (формирование драже, таблеток), розлива или фасовки, ампулирования (затаривания в ампулы).
ОЧИСТКА СТОКОВ И ВЫБРОСОВ
Таким образом, мы рассмотрели схему основного биотехнологического производства, которое на некоторых стадиях, если не на всех, имеет определенные стоки и выбросы в атмосферу. Очистка этих стоков и выбросов — специальная задача, которая обязательно должна решаться в наше экологически неблагополучное время. По существу очистка стоков — это отдельное биотехнологическое производство, имеющее свои подготовительные стадии, биотехнологическую стадию, стадию отстаивания биомассы активного ила и стадию дополнительной очистки стоков и переработки осадка. Очищенная вода иногда может быть возвращена в основное производство. Так организована, например, безотходная технология получения кормового белка из парафинов нефти. На заводе в г. Кириши после создания такой схемы удалось полностью ликвидировать технологические стоки в реку Волхов, а реально — просто заглушить трубопровод большого диаметра. И свежая вода стала забираться из реки Волхов только для компенсации потерь воды за счет испарения из градирен и с готовым продуктом (кормовой белок имеет влажность до 10%).
74.Составьте схему получения ферментов биотсх і ю. югн чес ким способом (Какие будут особенности в зависимости от нахождения фермеига внутри или вне клетки)
Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых веществ, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Процессы получения очищенных препаратов из поверхностных и глубинных культур несколько различны. Из поверхностных культур труднее получить высокоочищенные препараты из-за большого количества балластных веществ. Из глубинных культур получить очищенные препараты несколько легче, но при этом приходится вести выделение из разбавленных растворов, если выделение ферментов проводится из жидкой части культуры. Выделение осложняется, если фермент внутриклеточный, и тогда необходимо разрушать клетки микроорганизмов. Принципиальную схему выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов можно представить в виде следующей схемы. (рис.1.)
Рис.1. Схема выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов
Из схемы ясно, что экстракт из поверхностной культуры или фильтрат культуральной жидкости является исходным материалом для получения препаратов ферментов различной степени очистки. На первом этапе выделения отходом процесса является нерастворимая часть культуры – биошрот, содержащий нерастворимые включения среды и биомассу продуцента.
Далее в зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующего ему балласта схема очистки и получения ферментного препарата может включать различные приемы и методы, такие, как концентрирование, диализ, осаждение органическими растворителями, солями, гель-фильтрование, афинная хроматография, иммобилизация, сушка термолабильных материалов и т. д. Поэтому рассмотрим этапы получения ферментных препаратов.
Технологическая схема получения очищенных ферментных препаратов
Схемы получения ферментных препаратов зависят от свойств выделяемого фермента и методов очистки, примененных для получения препарата нужной степени чистоты. В качестве примера рассмотрим технологическую схему получения препаратов из поверхностной и глубинной культур в виде жидких концентратов, сухих технических препаратов, получаемых сушкой распылением, ипрепаратов, осажденных органическими растворителями (рис. 2, 3).
Фильтрат охлажденной культуральной жидкости собирается в основном сборнике и по мере надобности передается в сборник небольшой вместимости перед поступлением в подогреватель вакуум-выпарной установки пленочного типа. Концентрат культуральной жидкости с содержанием сухого вещества 6 – 10 % поступает в сборник концентрата. Для получения сухого техническогопрепарата концентрат направляют в башню распылительной сушилки 8. Сухой препарат через циклон 10, бункер 11 и шнек 12 попадает на стадию стандартизации, фасования и упаковывания.
Рис. 2. Принципиальная технологическая схема получения очищенных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных поверхностным способом
1 – сборник фильтрата культуральной жидкости; 2 – подогреватель вакуум-выпарной установки; 3 – сборник экстракта поверхностной культуры; 4 – конденсатор; 5 – сборник конденсата; 6 – вакуум-выпарной аппарат; 7 – сборник концентрата; 8 – распылительная сушилка; 9 – теплообменники; 10 – циклон; 11 – бункер для высушенного препарата; 12 – шнек; 13 – фильтр рукавный; 14 – установка для экстракции ферментов; 15 – сушилка для биошрота; 16 – резервуар для воды; 17 – стерилизационная установка для сточных вод; 18 – охлаждающий теплообменник; 19 – фасование и упаковывание жидкого препарата Г2х или П2х
Рис. 3. Принципиальная технологическая схема получения очищенных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных глубинным способом
1 – теплообменники; 2 – осадитель; 3 – дозаторы; 4 – сепаратор; 5 – насос для спирта; 6 – мерник для спирта; 7 – смеситель промывки осадка спиртом: 8 – центрифуга; 9 – вакуум-сушилка роторная; 10 – бункер для высушенного осадка; 11, 12 – бункера для наполнителей; 13 – бункер для сухого препарата; 14 – установки дисмембраторов; 15, 16 – весы; 17 – смесителинепрерывного действия; 18 – бункера для стандартизированного препарата; 19 – установки для фасования и упаковывания препаратов;
Для получения более очищенного препарата концентрат из сборника подается на осаждение органическим растворителем. Предварительно концентрат охлаждают в теплообменнике до температуры 2 – 3 °С и подают через дозатор в осадитель. Одновременно в осадитель дозируется охлажденный растворитель. Образовавшийся осадок отделяют на сепараторе 4. Надосадочную жидкость направляют на регенерацию, а осадок – на промывку спиртом и повторное сепарирование. Промытый осадок высушивают в вакууме, измельчают, взвешивают, смешивают с наполнителем и направляют на фасование и упаковывание.
При получении ферментных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных поверхностным способом, процесс очистки начинается с экстракции ферментов водой. Нерастворимый осадок высушивают и в виде сухого биошрота утилизируют на корм скоту.
Экстракт с содержанием сухого вещества 7 – 14 % при получении из него сухих препаратов не нуждается в дополнительном концентрировании и поэтому может быть сразу направлен на распылительную сушку с целью получения технического препарата, или же экстракт направляется в охладитель, а затем на осаждение органическими растворителями или солевыми растворами. Из экстракта можно получать стабильный жидкий концентрат с содержанием сухого вещества 50%, для чего экстракт направляют в сборник, затем в подогреватель и на вакуум-выпарную установку. Готовый жидкий концентрат фасуют в специальные емкости и направляют на склад готовой продукции. Из глубинной культуры можно также получать жидкие концентраты, например, методом ультрафильтрации.
Существуют многочисленные схемы получения ферментных препаратов различной степени очистки, вплоть до кристаллических и гомогенных препаратов. Такие схемы, созданные в различных странах мира, в большинстве своём очень сложны и сочетают в себе самые различные комбинации технологических приёмов. Поэтому давать какие-то общие рекомендации крайне трудно, и в каждом конкретном случае необходимо проводить кропотливые исследования на всех стадиях выделения фермента из данной культуры продуцента. Только в результате такой работы можно придти к практическим рекомендациям, которые будут справедливы только для данного фермента, данной культуры микроорганизма и для данной среды.
Получение неочищенных ферментных препаратов
Неочищенные ферментные препараты представляют собой культуру микроорганизма вместе с остатками питательной среды, высушенную при мягком режиме до влажности не более 8 – 12 %. Неочищенный ферментный препарат может быть получен на основе поверхностной или глубинной культуры. Глубинная культура может быть перед сушкой очищена от нерастворимой части (твердая взвесь среды и биомассы продуцента) или высушена вместе с ней.
Большинство продуцентов накапливает основную часть синтезируемых ими ферментов в питательной среде. При получении очищенных ферментных препаратов нерастворимую часть среды вместе с биомассой продуцента отделяют на фильтрах, центрифугах или сепараторах. На этой стадии стерильность процесса чаще всего нарушается.
Эффективность отделения биомассы во многом зависит не только от типов используемых аппаратов, но и от состава среды, размеров отделяемых частиц, количества нерастворимой фракции, физико-химических характеристик фильтрующих материалов, температурных режимов и т. д. Для улучшения процесса фильтрования проводят предварительную химическую обработку культуральной жидкости. Для этого культуральную жидкость подщелачивают до рН 8 – 8,5 и вводят 0,1 %-ный раствор хлористого кальция, в результате образуется гель фосфата кальция, который способствует наиболее полному отделению осадка при наименьших потерях. Но предварительная химическая обработка не всегда дает хорошие результаты, поэтому для повышения эффективности процесса часто используют различные кизельгуры, например, диатомит и радиолит (Япония), микрозил (Франция), диатомит (Бельгия), кларгель (Великобритания) и т. д. Использование этих наполнителей может резко повысить скорость фильтрования, но вместе с этим увеличиваются потери активности на этой технологической стадии.
Полученную биомассу продуцента вместе с нерастворимыми частицами среды (биошрот) при необходимости стерилизуют, высушивают и используют на корм животным. Фильтрат культуральной жидкости нестабилен, он не может храниться и должен немедленно направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.
Экстрагирование ферментов
Все ферменты являются водорастворимыми белками, поэтому наилучшим экстрагентом для них является вода. Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо подвергнуть механическому или автолитическому разрушению их клеточные стенки, обладающие высоким диффузионным сопротивлением. Оболочки мицелиальных нитей имеют меньшее диффузионное сопротивление, чем оболочки бактериальных и дрожжевых клеток, поэтому дезинтеграции культуры грибов не требуется.
Извлечение ферментов проводят как из влажных, так и из сухих поверхностных культур грибов. Сухая культура может храниться длительное время без потери активности ферментов, и из нее получают более концентрированные экстракты. Технологически это выгоднее, но при подсушивании культуры имеют место потери активности, и потому экстрагирование целесообразно вести из влажной культуры. При экстрагировании различные водорастворимые вещества извлекаются из культуры с неодинаковой скоростью, происходит их частичное фракционирование, удельная активность ферментов в экстракте повышается в 3,5 – 4 раза по сравнению с исходной культурой в результате отделения большой части веществ (до 75 %) с нерастворимым остатком – биошротом.
На полноту экстрагирования ферментов из культур оказывают влияние многие факторы: температура, рН, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого фермента, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и т. д.
Одновременно с ферментами экстрагируются многие другие соединения, и часто скорость извлечения балластных веществ больше скорости экстрагирования из культуры целевого фермента. Поэтому рациональнее пойти на некоторые потери фермента и закончить экстрагирование на оптимальном значении отношения активности фермента в экстракте к сумме извлекаемых веществ. Этот вопрос решается экспериментально для каждого вида продуцента.
Влиять на процесс экстрагирования с помощью такого фактора, как температура, практически невозможно, так как ферменты очень термолабильны и инактивируются даже при 35 – 40 °С (рис. 3). Кроме того, повышение температуры до 35 – 40 °С влечет за собой увеличение содержания сухого вещества в экстракте и уменьшение удельной ферментативной активности на 1 г сухого вещества, повышение опасности инфицирования экстрактов. Поэтому при проведении экстракции в заводских условиях стремятся подавить развитие микрофлоры путем максимального снижения температуры воды до 22 – 25 °С и применения антисептиков (формалин, бензол, толуол, хлороформ и др.). В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5 – 7.
Рис.3. Влияние температуры на процесс экстрагирования
Для получения концентрированных экстрактов при небольших потерях ферментов с биошротом необходимо применять специальные экстракционные установки. Ранее широко использовались диффузионные батареи (рис. 4). В них можно получить экстракт с содержанием сухого вещества от 7 до 14 % в зависимости от вида культуры, среды и величины отбора экстракта. Но эти установки для экстрагирования ферментов из поверхностной культуры имели сравнительно небольшую производительность, требовали больших затрат ручного труда, и в них наблюдались сравнительно большие потери активности.
Рис.4. Диффузные батареи
Более перспективным в этом отношении является экстрактор непрерывного действия фирмы «Ниро Атомайзер» (Япония), работающий под избыточным давлением (рис. 6). Экстрактор представляет собой наклонную цилиндрическую емкость, снабженную двумя шнеками, теплообменнымирубашками и насосами. Культура через дозирующее устройство 5 подается внутрь цилиндра, а с противоположной стороны вводится растворитель (вода).
Рис.5. Экстрактор непрерывного действия фирмы «Ниро Атомайзер» (Япония)
Экстракт выходит из установки через самоочищающийся фильтр, а биошрот удаляется с противоположного конца. В случае необходимости, если ферменты экстрагируются не полностью, можно осуществлять двухступенчатое экстрагирование, увеличивая длительность процесса. Вторичный экстракт может быть использован в качестве растворителя для первой ступени экстрагирования. Общая продолжительность экстрагирования регулируется частотой вращения шнеков. Вторичный биошрот используется как компонент среды или после обеспложивания в кормопроизводстве.
Концентрирование ферментных растворов методом вакуум-выпаривания
Экстракты из поверхностных культур микроорганизмов и фильтраты глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм технических препаратов (П2х и Г2х) их необходимо сконцентрировать. Чаще всего для этих целей в технологии ферментных препаратовиспользуются методы вакуум-выпаривания. Вакуум-выпаривание также применяется как один из этапов получения сухих технических или очищенных ферментных препаратов. Ферменты очень чувствительны к температуре выпаривания, поэтому основным условием концентрирования ферментных растворов является кратковременное ведение процесса при низких температурах кипения, чтобы выпариваемая жидкость не перегрелась, а ферменты не инактивировались. Следует учитывать, что чем чище раствор, чем меньше он содержит сопутствующих веществ, тем ферменты более чувствительны к воздействию высоких температур. При концентрировании экстрактов из поверхностных культур инактивация ферментов значительно меньше, так как в экстракте содержится очень большое количество защитных соединений, которые препятствуют инактивации ферментов. При концентрировании фильтратов культуральной жидкости наблюдаются несколько большие потери, поэтому ферменты культуральной жидкости стабилизируют различными соединениями. В процессе концентрирования ферментных растворов происходят изменение растворимости многих соединений и выпадение их осадков, и суммарное содержание сухого вещества в концентрате снижается на 11 – 20 %, изменяется рН концентрата. В осадок выпадают минеральные соли, некоторые органические вещества и продукты их распада, наблюдается потеря азота в результате уноса аммиака.
При концентрировании культуральной жидкости В. mesentericus значительно изменяется минеральный состав концентрата. Наиболее резко снижается содержание кальция, меди и магния, заметно уменьшается содержание цинка и марганца. Такое изменение минерального состава культуральной жидкости сказывается на стабильности ферментов в процессе концентрирования. При сгущении культуральной жидкости до содержания сухого вещества 10 % количество кальция снижается всего на 5 %, а меди – на 75 %. Известно, например, что медь оказывает на ферменты ингибирующее действие, а кальций – стабилизирующее. Поэтому на первых стадиях концентрирования наблюдается повышение активности ферментов, особенно протеиназ. При более глубоком концентрировании вместе с резким снижением содержания кальция снижается активность ферментов.
Большинство ферментов очень чувствительно к термической обработке и нуждается в мягких режимах концентрирования. На рисунке были приведены данные по инактивации нейтральной протеиназы В. subtilis 103 в зависимости от температуры кипения раствора от 20 до 50 °С и температуры греющего пара от 90 до 120 °С. Из рисунка видно, что очень большое влияние оказывает температура теплоносителя. При низких температурах кипения (25 – 30 °С) происходит заметная инактивация ферментов (до 12 %), если температура греющего пара равна 120 °С. При температуре теплоносителя 90 – 100 °С и температуре кипения 35 – 40 °С потери активности не превышают 10 %. В зависимости от вида продуцента культуральная жидкость имеет различный химический состав и содержит различный комплекс ферментов, поэтому тепловые режимы вакуум-выпаривания уточняются экспериментальным путем.
Суммарные потери активности при вакуум-выпаривании в значительной степени зависят не только от режима концентрирования, но и от конструкции аппарата. Аппараты для стадии вакуум-выпаривания в последние годы значительно усовершенствованы, в десятки раз сокращена длительность процесса, что привело к значительному уменьшению потерь активности ферментов, а также позволило несколько ужесточить температурные режимы концентрирования ферментных растворов. Помимо трубчатых вакуум-выпарных установок с различным расположением трубой (горизонтальным, вертикальным и наклонным), со встроенной и выносной поверхностью нагрева, с использованием принудительной циркуляции созданы новые конструкции пленочных выпарных аппаратов, ультрацентробежных вакуум-выпарных установок и пластинчатых испарителей. Особый интерес представляют ротационные пленочные выпарные аппараты, где упариваемая жидкость в виде пленки движется по внутренней стенке аппарата. Лопатки, смонтированные на вращающемся роторе, непрерывно направляют движение ее сверху вниз. Время прохождения жидкости через аппарат составляет несколько секунд. В настоящее время фирма «Альфа-Лаваль» изготовляет вакуум-выпарные центробежные аппараты типа «Центритерм». Они очень компактны, время контакта ферментного раствора с обогревающей поверхностью предельно сокращено (не более 1 с), потери не превышают 10 %, производительность этих установок от 800 до 4800 л/ч.
Создана центробежная вакуум-выпарная установка пленочного типа производительностью 800 л/ч по испаренной влаге. Время контакта культуральной жидкости с теплоносителем не более 1 с, температура греющего пара 60 – 80 °С. Для увеличения производительности можно монтировать установку из трех модулей, каждый из которых работает либо автономно, либо последовательно, либо первые два модуля работают параллельно и соединены с третьим модулем последовательно. Представляет интерес для ферментной промышленности центробежная пленочного типа вакуум-выпарная установка «Единство» (Югославия) производительностью до 200 л/ч и с температурой упаривания 30 – 40 °С. Хорошие технологические показатели имеют роторные выпарные аппараты фирмы «Люва» (Швейцария), имеющие производительность по испаренной влаге от 50 до 200 л/(м2·ч). Французская фирма APV изготовляет пластинчатые вакуум-выпарные установки производительностью до 20 000 л/ч.
Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удается (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.
75.Лекарственные препараты бактериофагов Механизм воздействия
Бактериофаг представляет собой вирус бактерий, который проникает в бактериальную клетку, размножается в ней, разрушая ее, выходит в виде зрелых частиц, готовых к заражению новых бактериальных клеток. ПИО БАКТЕРИОФАГ обладает строгой специфичностью по отношению к гомологичным бактериям, в связи с чем не подавляет нормальную микрофлору и безвреден для клеток организма человека.
ПИО БАКТЕРИОФАГ адсорбируется на мембране клетки гомологичной бактерии, например: Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus, что обеспечивает высокую активность и эффективность препарата. Кроме того, препарат оказывает стимулирующее действие на иммунную систему больного и эффективен при лечении гнойно-септических заболеваний, сопровождающихся иммунодепрессивными состояниями.
Показания к применению
Лечение и профилактика гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных бактериями Streptococcus,Staphylococcus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
-инфекции лор-органов и дыхательных путей (воспаление пазух носа, среднего уха, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит)
– хирургические инфекции (гнойная рана, ожог, абсцесс, флегмона, фурункул, карбункул, гидроаденит, панариций, парапроктит, мастит, бурсит, остеомиелит)
– урогенитальные инфекции (уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингоофорит)
– инфекции желудочно-кишечного тракта (стоматит, парадонтит, холецистит, энтероколит, дисбактериоз кишечника)
– генерализованные септические заболевания
– гнойно-воспалительные заболевания новорожденных (омфалит, пиодермия, конъюнктивит, сепсис)
– обработка свежих ран для профилактики гнойных осложнений при хирургических манипуляциях и операциях
– профилактика бактериальных осложнений при острых респираторно-вирусных заболеваниях
Способ применения и дозы
Важным условием успешного применения препаратов бактериофагов является определение фагочувствительности возбудителя и раннее применение препарата. Особенно эффективен препарат в начальной стадии заболевания и при применении непосредственно в очаге поражения.
ПИО БАКТЕРИОФАГ назначается для приема внутрь (через рот), в виде клизм, местно (в виде полосканий, орошений, примочек), для введения в полость: раны, абсцесса, брюшной, плевральной полости, флегмоны, носа, среднего уха, мочевого пузыря, матки, влагалища.
Для лечения гнойно-воспалительных заболеваний с локальными поражениями ПИО БАКТЕРИОФАГ назначается одновременно как местно, так и для приема внутрь. Длительность курса лечения препаратом от 5 до 10 дней. Дозировка определяется индивидуально, в зависимости oт размеров пораженного участка. Препарат вводится в полость очага после удаления гноя с помощью пункции. Количество вводимого препарата должно быть несколько меньше объема удаленного гноя. В последующие дни, вводится препарат в инфицированную полость, с помощью дренажа. Процедура проводится 1 раз в день, в течение 3-5 дней.
При циститах, пиелонефритах, уретритах препарат принимается внутрь. В случае если полость мочевого пузыря или почечной лоханки дренированы, бактериофаг вводят 2 раза в день по 20-30 мл в мочевой пузырь и по 5-10 мл в почечную лоханку.
При гнойно-воспалительных гинекологических заболеваниях препарат вводится в полость вагины, матки, в дозе 5-10 мл ежедневно, однократно.
При гнойно-воспалительных заболеваниях уха, горла, носа препарат вводится местно в дозе 2-10 мл 2 -3 раза в день. Бактериофаг используют для полоскания, промывания, закапывания, введения смоченных турунд (оставляя их на I час). Для лечения гнойного тонзиллита препарат применяется для полоскания и назначается одновременно внутрь.
При лечении стоматитов и хронических генерализованных парадонтитов
препарат применяется в виде полосканий полости рта 3-4 раза в день в дозе 10-20 мл, а также вводятся в парадонтальные карманы турунды, пропитанные ПИО БАКЛЕРИОФАГОМ, на 5-10 минут.
При кишечных инфекциях, заболеваниях внутренних органов, дисбактериозе кишечника ПИО БАКТЕРИОФАГ применяется перорально внутрь или в клизме. Назначается натощак за 0,5 -1 час до еды. В виде клизм назначается 1 раза в день, вечером перед сном, после опорожнения кишечника.
Рекомендуемые дозировки препарата при всех заболеваниях, при которых показан прием внутрь и в клизме
Возраст Внутрь (в день) В клизме (в день)
Дети в возрасте от 0 до 6 месяцев 5мл х 1 раз за 30мин до кормления 10 мл х1 раз
Дети в возрасте от 6 до 12 месяцев 5мл х 2 раз за 30мин до еды 10 мл х1 раз
Дети в возрасте от 1 года до 3 лет 5мл х 3 раз за 1 час до еды 20 мл х1 раз
Дети в возрасте от 3 лет до 8 лет 10мл х 2-3 раз за 1 час до еды 30 мл х1 раз
Дети старше 8 лет, взрослые 20мл х 2-3 раз за 1 час до еды 40 мл х1 раз
Свежие раны для профилактики гнойных осложнений при хирургических манипуляциях и операциях обрабатывают ПИО БАКТЕРИОФАГОМ в количестве, зависящем от размера раны, 1-2 раза в день. Продолжительность определяется врачом.
Для профилактики бактериальных осложнений при острых респираторно-вирусных заболеваниях ПИО БАКТЕРИОФАГ принимают внутрь в выше указанных дозировках 1раз в день в течение 5-7 дней.
Примечание
В случае, если до применения препарата ПИО БАКТЕРИОФАГ для лечения ран применялись химические антисептики, рана должна быть тщательно промыта стерильным 0,9% раствором натрия хлорида.
Побочные действия
Нежелательные эффекты и реакции, связанные с применением ПИО БАКТЕРИОФАГА не отмечены.
Противопоказания
-гиперчувствительность к какому-либо компоненту препарата
Лекарственные взаимодействия
Взаимодействие с другими лекарственными средствами препаратов бактериофагов не установлено. Применение ПИО БАКЛЕРИОФАГА не исключает использования других антибактериальных препаратов.
Особые указания
Особые меры предосторожности при применении ПИО БАКЛЕРИОФАГА не предлагаются. Рекомендуется извлекать содержимое флакона стерильным шприцем. Допускается применение содержимого флакона в течение 24 часов после вскрытия, при хранении в соответствующих условиях.
Беременность и период лактации
Препараты бактериофагов можно применять в период беременности и лактации.
Особенности влияния лекарственного средства на способность управлять транспортным средством и потенциально опасными механизмами
Препараты бактериофагов не оказывают влияния на способность управлять автомобилем и выполнять работы, требующие повышенной концентрации внимания и двигательной реакции.
Передозировка
Случаи передозировки не известны.
Форма выпуска и упаковка
По 20 мл во флаконах из медицинского стекла, укупоренных пробками из резины и завальцованных алюминиевыми колпачками. По 4 флакона вместе с инструкцией по применению на государственном и русском языках помещают в коробку из картона.
Условия хранения
Хранить при температуре 6±4°С, в сухом, защищенном oт света месте. Допускается транспортирование при температуре от 2 до 20°С всеми видами крытого транспорта, обеспечивающего стабильный терморежим в течение всего времени транспортирования, со сроком транспортировки не более 2 недель.
Хранить в недоступном для детей месте!
Срок хранения
2 года
Не применять после истечения срока годности, указанного на упаковке.
Не следует применять препараты бактериофагов при помутнении.
76.Назовите основные условия получения культуры тканей растительных клеток
Стадия биосинтеза – основная биологическая стадия процесса получения БАВ на основе культуры растительных тканей.
