1 Метод изолирования лекарственных веществ подкисленной водой по В

1. Метод изолирования лекарственных веществ подкисленной водой по В.А. Крамаренко. [1]
Изолирование подкисленной водой
Этот метод является одним из наиболее эффективных и доступных. Соли многих лекарственных и наркотических веществ лучше растворяются в подкисленной воде, чем в подкисленном спирте.
Вода, подкисленная щавелевой кислотой, была предложена в 1856 г. С. Макадамом для выделения алкалоидов из биологических объектов. Для очистки извлечений был использован активированный уголь.
В 1865 г. Г. Драгендорф для подкисления объекта при изолировании алкалоидов предложил использовать серную кислоту. Однако способы дальнейшей обработки извлечений были слишком громоздки, и поэтому эти методы не получили широкого распространения.
В 1942 г. А.В.Степанов и М.Д.Швайкова разработали метод экстракции алкалоидов подкисленной водой из растительных объектов (пищевых продуктов). Этот метод в 1947 г. был модифицирован и применен А.А.Васильевой для экстракции алкалоидов из свежих биологических объектов, после чего подкисленная вода стала широко использоваться в практике химико-токсикологического анализа при изолировании различных токсических веществ.
Эти методы получили дальнейшее развитие и совершенствование в работах многих ученых. В.Ф.Крамаренко и его учениками (В.И.Поповой, Б.В.Швыдким, З.С.Рокач и др.) были изучены оптимальные условия экстракции алкалоидов из трупного материала и из водных растворов. Ими были установлены оптимальное значение рН для максимальной экстракции алкалоидов, условия разрушения комплекса алкалоидов с белками и изучены влияние электролитов и их оптимальной концентрации на изолирование ядовитых веществ, способы осаждения белков и удаления их из полученных водных вытяжек. Процесс фильтрования был заменен центрифугированием. Определена пригодность метода при анализе как свежего, так и загнившего трупного материала.
Разработка и детальное изучение оптимальных условий экстракции позволили внести изменения и в ранее предложенные методы изолирования лекарственных и наркотических веществ.
Метод В.Ф.Крамаренко
1-й этап. Навеску измельченного объекта массой 100 г заливают 0,02 М раствором серной кислоты (рН=2,5) и настаивают 2 раза: 2 ч и 1 ч. Водные вытяжки центрифугируют, отделяют от осадка, насыщают сульфатом аммония и вновь центрифугируют. Центрифугат (рН=2,5) экстрагируют диэтиловым эфиром с целью очистки.
2-й этап. Водную фазу после подщелачивания до рН=8,5-9 раствором гидроксида натрия экстрагируют 4 раза хлороформом.
Оценка метода. В методе максимально учтены химические свойства алкалоидов и органических оснований. Поэтому условия изолирования и последующей экстракции оптимальны для определения алкалоидов.
2. ХТА на производные фенотиазина. [2]
Предварительная проба.
К 2 мл мочи прибавляют 1 мл реактива FPN. При наличии в исследуемойпробе производных фенотиазина мгновенно развивается окрашивание от розового до синего в зависимости от структуры и количеств соединений висследуемой пробе. Проба с реактивом FPN не специфична и имеет толькоотрицательное значение. При отрицательном результате пробы дальнейшееисследование мочи на наличие производных фенотиазина не проводится.
Изолирование. 5-10 мл мочи или 2 мл крови подщелачивают 50%-нымраствором едкого натра до рН 13 и смесь кипятят в течение 10 минут наводяной бане. Полученный гидролизат охлаждают до комнатной температуры идважды (по 20 мл) экстрагируют н-гептаном, содержащим 3%-ныйизоамиловый спирт. Гептановые извлечения из мочи объединяют, промываютводой, насыщенной гептаном, и делят на две равные части. В одной частипроводится обнаружение производных фенотиазина методом тонкослойнойхроматографии, а в другой – количественное определение. Экстракт из кровиполностью расходуется на количественное определение, так как содержитменьшее количество соэкстрагируемых веществ.
Хроматографическая очистка и обнаружение. Из аликвоты органического экстракта удаляют в токе теплого воздуха органическийрастворитель. Сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл хлороформа иполученный раствор поровну наносят на две пластинки “Силуфол” В качествеметчиков наносят аминазин (обязательно) и те производные фенотиазина,которые были обнаружены в процессе предварительного исследования (ТСХ-скрининг). Хроматографирование проводят в системе 1 и 2. Длина пробега -10 см.
Система -1: бензол – диоксан – 25%-ный раствор аммиака (60 : 35 : 5).
Система -2: этилацетат — ацетон – 25%-ный раствор аммиака в этаноле(1:1) (50:45: 4).
Реагенты, используемые для проявления пластинки.
Одну пластинку опрыскивают раствором концентрированной сернойкислоты в этаноле (1:9) и при положительном результате на второй пластинкеобнаружение проводят с помощью реактива Марки.
3. Дифференциальная Уф-спектроскопия в анализе производных барбитуровой кислоты. [1]
Дифференциальная спектрофотометрия. Хотя этот термин принят в аналитической химии, его правильнее назвать разностной фотометрией. Количественное определение проводят в этом случае по разности величины оптической плотности исследуемого и контрольного опытов. Методы дифференциальной фотометрии разрабатывались длительное время в Пятигорской фармацевтической академии под руководством В.Г.Беликова.
Особый интерес вызывает так называемая химическая дифференциальная спектрофотометрия. Этот метод приемлем в том случае, когда при различных значениях рН среды изменяется спектр поглощения исследуемого вещества, а спектр поглощения примесей (посторонних экстрактивных веществ) остается без изменений. Такая методика предложена для определения производных барбитуровой кислоты.
Барбитураты изолируют из биологических объектов общими (Стаса-Отто,Васильевой) или частными (Валова, Поповой) методами. Для экстракции барбитуратов из водной фазы при рН=2-2,5 применяют диэтиловый эфир или хлороформ.
В основу метода дифференциальной спектрофотометрии положена способность барбитуратов к лактим-лактамной (имидо-имидольной) таутомерии. В органическом растворителе после экстракции барбитураты находятся в лактамной форме.
В этом случае спектр поглощения барбитурата представляет собой ниспадающую кривую 1 (рис. 1) в области 220-320 нм. Это связано с тем, что в лактамной форме в молекуле барбитурата отсутствуют сопряженные двойные связи.
При значении рН=10 барбитураты перейдут в лактимную форму.
При регистрации спектра такого раствора обнаруживается максимум светопоглощения при 240 нм (см. рис. 1, кривая 2).
При значении рН=13 барбитураты перейдут в дилактимную форму.
Спектр поглощения барбитурата в этом случае имеет полосу с максимумом при 260 нм (см. рис. 1, кривая 3).
Для расчета количества барбитурата в извлечении из объекта используют метод дифференциальной спектрофотометрии.
При исследовании внутренних органов определяют разницу в оптической плотности при рН=10 и рН=2 при длине волны 240 нм.
При исследовании биологических жидкостей определяют разницу в оптической плотности при рН=13 и рН=10 при длине волны 260 нм.
Расчет содержания барбитуратов проводят по удельному показателю поглощения, который рассчитывают при тех же значениях рН для раствора стандартного образца.
Более воспроизводимые результаты получаются в том случае, когда расчеты проводят по стандартному образцу.
Использование дифференциального варианта спектрофотометрического определения барбитуратов позволяет получить достаточно надежные результаты и исключить влияние посторонних веществ, экстрагируемых в процессе анализа вместе с барбитуратами из раствора при рН=2-2,5.
4. Сурьма и таллий в химико-токсикологическом отношении. [1]
Соединения сурьмы
Свойства и токсикологическое значение. Сурьма – серебристо-белый металл с синеватым оттенком, грубозернистого строения. Сурьма растворяется в концентрированной серной кислоте с образованием солей Sb2(SO4)3, в присутствии концентрированной азотной кислоты окисляется до сурьмяной кислоты Н[Sb(ОН)6]. Соли сурьмяной кислоты легко гидролизуются. Сурьма находит применение при получении сплавов для типографских шрифтов, подшипников, дроби, пуль, при цинковании кровельного железа, посуды, при изготовлении пластин цинковых аккумуляторов. В промышленности используются оксиды и соли сурьмы. Их применяют при изготовлении огнеупорных красок, эмалей, в качестве протравы в текстильной промышленности, для изготовления оптического стекла, керамики, резины, в пиротехнике, при вулканизации и окраске каучука, приизготовлении огнестойких текстильных изделий.
В организм соединения сурьмы могут поступать через дыхательные пути и желудочно-кишечный тракт.
При вдыхании паров или аэрозолей соединений сурьмы наблюдается раздражение слизистых оболочек глаз, помутнение роговицы, появляются общая слабость, насморк, стеснение в груди, тошнота, затрудненное дыхание, переходящее в удушье. Температура тела повышается, отмечаются заболевания верхних дыхательных путей, бронхиты, острые желудочно-кишечные расстройства. Развиваются признаки, свойственные «металлической лихорадке», в крови – гемолитическая анемия и эозинофилия. Поражаютсяцентральная, периферическая нервная система и сердечная мышца.
При попадании в желудок (острое отравление) ощущается металлический вкус во рту, тошнота, рвота, боли в животе, понос с кровью. В тяжелых случаях наступает анурия, судороги, коллапс и смерть.
Хронические отравления. Основное действие соединений сурьмы – угнетение обмена веществ, поражение нервной системы и сердечной мышцы. Под влиянием соединений сурьмы нарушается ионный обмен, развивается дефицит внутриклеточного калия. За счет связывания сульфгидрильных групп белков и низкомолекулярных соединений нарушается обмен белков и углеводов. На кожных покровах наблюдается зуд, покраснение, пузырьковая сыпь, гнойнички. Поражается кожа головы, подбородка, век, внутренняя стенка ноздрей, наблюдается кайма на губах, сухость кожи, трещины на пальцахи около ноздрей. При хронических отравлениях сурьма из организма выводится очень медленно.
Соединения Sb(III) токсичнее соединений Sb(V) и обладают сильным раздражающим действием. Токсичность галогенидов сурьмы объясняется также действием продуктов гидролиза HCl и HF. Смертельная доза соединений Sb(III) составляет 0,12-1,0 г. Соединения Sb(lII) обладают высоким сродством к белковой части гемоглобина и концентрируются в эритроцитах, а соединения Sb(V) задерживаются в плазме крови.
Сурьма накапливается в легких, печени, почках. Металлическая сурьма и соединения Sb(ІІІ) выделяются через кишечник, Sb(V) – преимущественно почками.
При вскрытии наблюдается гиперемия легких, кровоизлияния в легких и в ЖКТ.
Для обнаружения сурьмы в минерализате предложена атомно-абсорбционная спектрометрия и химический метод.
Соединения таллия
Свойства и токсикологическое значение. Таллий – белый металл с голубоватым оттенком. Он быстро окисляется на воздухе. Таллий применяется для производства подшипниковых кислотоустойчивых сплавов, в производстве специальных термометров, в различных приборах.
В настоящее время применяются неорганические и органические соединения таллия, они находят применение для изготовления линз и деталей приборов ИК-техники, ювелирных украшений, наполнения газозарядных ламп зеленого цвета, в производстве средств для удаления волос, в качестве дератизаторов и для других целей.
Соединения таллия могут попасть в организм через ЖКТ, ингаляционным путем в виде аэрозоля и через кожные покровы (в течение часа соли таллия могут всасываться на 100%). В организме таллий конкурируете ионами калия в биохимических процессах за механизмы переноса ионов через биологические мембраны. Таллий замешает калий и выступает конкурентом в других жизненно важных процессах. Он вступает во взаимодействие с жирными кислотами сальных желез кожи, образует жирорастворимые соединения и таким образом проникает через кожный барьер.
Острое отравление. Скрытый период продолжается до 12-14 ч. Наиболее выраженная картина на 2-3-й неделе от момента отравления. Наблюдается тошнота, общая слабость, бессонница, усиленное слюноотделение. Затем развивается тахикардия, перебои в сердце в виде парестезии, онемение рук, губ. Токсическое действие усугубляется обезвоживанием и приводит к судорогам, галлюцинациям, болям в суставах, воспалению почек, интоксикационным психозам. Смерть наступает в результате нарушения сердечной деятельности и функции почек. Смертельная доза составляет при поступлении черезЖКТ 0,1-2 г. Водорастворимые соли таллия (ацетат, хлорид) более токсичны, чем малорастворимые (йодид).
Хроническое отравление протекает незаметно, начинается облысение, дерматиты, лишаеподобные сыпи. Возникает слабость мышц, их атрофия, изменяется окраска волос, они чернеют, выпадают. Действие таллия на волосы объясняется нарушением образования кератина в волосяных луковицах. Ногти деформируются, характерна голубоватая линия на деснах около зубных лунок. Обнаруживается неврит, атрофия зрительного нерва (снижение остроты зрения, нарушение цветоощущения), снижение памяти и интеллекта.
Таллий накапливается в организме в межклеточной жидкости, вступает в соединение с аминокислотами, откладывается в костях в виде фосфатов. Таллий быстро исчезает из крови после всасывания, распределяется по органам, концентрируясь, в основном, в почках и слюнных железах, костях, кишечнике, селезенке. Накапливается таллий в костях и волосах.
При вскрытии погибших от отравления соединениями таллия наблюдают кровоизлияния и некроз слизистой оболочки пищеварительного канала, дистрофические и некротические изменения в почках, перерождение печени и миокарда.
При химико-токсикологических исследованиях для обнаружения таллия в минерализате предложены атомно-абсорбционная спектрометрия и химический метод.
5. Карбаматные пестициды: особенности анализа, конкретные примеры. [1]
Предварительное исследование объекта на карбаматы
Реакция с фурфуролам. К 1 мл исследуемого объекта (содержимого желудка) добавляют 0,5 мл разбавленной хлороводородной кислоты и экстрагируют 4 мл хлороформа. Хлороформный экстракт выпаривают досуха. Остаток растворяют в 0,1 мл метилового спирта и раствор наносят на фильтровальную бумагу. После подсушивания на пятно наносят 0,1 мл фурфурола и снова подсушивают. Фильтровальную бумагу выдерживают в течение 5 мин над концентрированной хлороводородной кислотой. При наличии производных карбаминовой кислоты пятно окрашивается в черный цвет.
Изолирование севина и его основного метаболита 1-нафтола проводится бензолом. Навеску биоматериала массой 100 г заливают 100 мл бензола, периодически помешивают в течение часа. Затем бензол сливают и экстрагирование повторяют еще дважды (по 100 мл). Бензольные вытяжки объединяют, фильтруют и отгоняют бензол на водянойбане до небольшого объема. Остаток выпаривают под вытяжным шкафом при комнатной температуре досуха. Полученный остаток растворяют в 10 мл спирта. При получении окрашенного в желто-бурый цвет остатка его подвергают очистке. С этой целью к сухому остатку добавляют смесь из 20% раствора аммиака, концентрированной фосфорной кислоты и ацетона 3:2:5. Для удаления ацетона жидкость нагревают на водяной бане при 40°С. Затем охлажденный раствор экстрагируют трижды 20 мл хлороформа.Хлороформные вытяжки объединяют, выпаривают на водяной бане досуха, остаток растворяют в 5 мл этилового спирта. В полученном растворе будут находиться севин и 1-нафтол.
Обнаружение севина. Севин гидролизуют до 1-нафтола и проводят реакции с 4-аминофеназоном, хлоридом меди и бромидом калия, с хлоридом железа(Ш), с нитритом натрия. Для обнаружения севина используют также хроматографию в тонком слое сорбента и микрокристаллоскопические реакции.
Реакция с 4-аминофенаюном. В пробирку вносят 1 мл спиртового раствора, полученного после изолирования, и 0,5 мл аммиачной буферной смеси (растворяют 10 г хлорида аммония в 50 мл 25% раствора аммиака). Пробирку нагревают на водяной бане при температуре 55-60°С (с воздушным холодильником) в течение 15 мин. После охлаждения добавляют три капли 0,5% водного раствора 4-аминофеназона и 6 капель 10% водногораствора гексацианоферрата(Ш) калия – появляется оранжево-красное окрашивание.
Реакция с хлоридом меди и бромидом калия. В пробирку вносят 1 мл спиртового раствора полученного после изолирования, 0,4 мл 0,5 М раствора гидроксида натрия и нагревают на водяной бане в течение 10 мин при 55°С (с воздушным холодильником). После охлаждения добавляют 0,5 М хлороводородную кислоту до рН=5-6 и 1 мл свежеприготовленной смеси, содержащей 0,1 г хлорида меди(Н), 4 г бромида натрия и 5,9 мл воды очищенной. При нагревании смеси до 60°С раствор окрашивается в красно-фиолетовый цвет. При взбалтывании с хлороформом окрашенное соединение переходит в слой хлороформа.
Реакция с хлоридом железа(Ш). При добавлении к спиртовому раствору капли 1% раствора хлорида железа(Ш) появляется розовое окрашивание.
Реакция с нитритом натрия. При добавлении к спиртовому раствору 0,5% раствора нитрита натрия и разбавленной серной кислоты образуется желтое окрашивание, которое переходит в оранжевое при добавлении гидроксида натрия.
Реакция с пикриновой кислотой. На предметное стекло наносят 1 каплю исследуемого раствора и испаряют досуха. К остатку добавляют 1 каплю раствора пикриновой кислоты. Через 10-15 мин появляются темно-желтые кристаллы, собранные в пучки. При малом содержании севина кристаллы образуются очень медленно (рис. 98).
Реакция перекристаллизации. Из спиртового раствора севин кристаллизуется (рис. 99) при испарении растворителя в виде характерных сростков кристаллов (крестов и дендритов).
Обнаружение севина и 1-нафтола методом ТСХ. На пластинку с закрепленным слоем оксида алюминия наносят каплю спиртового раствора остатка извлечения из объекта и – в качестве «стандартов» – растворы севина и 1 -нафтола. Пластинку помещают в систему растворителей хлороформ – бензол – ацетон (7:2:1). После хроматографирования и высушивания пластинки на воздухе ее облучают УФ-лампой. При наличии севина или 1-нафтола их пятна флуоресцируют. Затем пластинку опрыскивают щелочным раствором диазотированной сульфаниловой кислоты. При этом пятна на пластинке приобретают красное окрашивание.
Количественное определение. Для количественного определения севина используют фотоколориметрический метод. Он основан на омылении севина до 1-нафтола и получении окрашенного соединения с хлоридом меди и бромидом калия (купробромидом) по описанной в разделе «обнаружение севина» методике. Окрашенный в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет слой хлороформа отделяют и в полученном растворе регистрируют оптическую плотность с помощью фотоколориметра при 420 нм (синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см. Расчет содержания севина в исследуемом объекте ведут по калибровочному графику.
Литература:
Вергейчик Т.Х. Токсикологическая химия : учебник / Т.Х.Вергейчик ; под ред. проф. Е.Н.Вергейчика. – М.: МЕДпресс-информ, 2009. – 400 с. : ил.
Учебно-методическое пособие для студентов по специальности 060108 – Фармация: Химико-токсикологический анализ на группу веществ, изолируемых экстракцией и сорбцией. наркотические и другие одурманивающие средства, Воронеж, 2004.
http://www.pharm.vsu.ru/sources/tox_1.pdf